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淋巴細(xì)胞的保存和活力測定

一、分離細(xì)胞的保存

在某些情況下，分離所得細(xì)胞需要加以保存，否則活力迅速下降，甚至死亡。

(一)短期保存技術(shù)

將 分離到的細(xì)胞用適量含10%～20%滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培養(yǎng)液稀釋重懸。所用培養(yǎng)液要求等滲，具緩沖作用， 并對細(xì)胞無毒性。通常置4℃保存較好，可減低細(xì)胞代謝活動。要注意不要迅速改變細(xì)胞所處的溫度，以免造成細(xì)胞“溫度”休克。

(二)長期冷凍保存技術(shù)

利 用液氮深低溫(-196℃)環(huán)境保存細(xì)胞，是當(dāng)前世界上通用的細(xì)胞長期保存技術(shù)。其原理在于深低溫環(huán)境可中斷細(xì)胞的代謝，但在降溫過程由于冰晶的形成和滲 透壓的改變均可導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和部分死亡，所以在冷凍過程中一定要加用冷凍保護(hù)劑，常用的保護(hù)劑為二甲亞砜 (dimethylsulfoxide，DMSO)。冷凍時的降溫速度和細(xì)胞解凍時的升溫速度對細(xì)胞活力的保存有很大影響。條件合適時，凍存細(xì)胞一旦復(fù) 蘇，恢復(fù)37℃培養(yǎng)，其形態(tài)和代謝活動均可恢復(fù)正常。操作的原則是先對需凍存的細(xì)胞作活細(xì)胞計數(shù)，低速離心后，取沉積細(xì)胞用含10%二甲亞砜的小牛血清配 制成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管內(nèi)，速即放入降溫過渡站中，避免二甲亞砜對細(xì)胞的損傷。繼而進(jìn)行降溫冷凍，目前常用兩步降溫法，即迅速降溫至一選擇 好的臨界溫作為過渡站，如-80℃低溫冰箱過夜，或在液氮罐液面以上的一層空間放置片刻，然后再放入液氮中。如需復(fù)蘇細(xì)胞，則需迅速解凍以恢復(fù)細(xì)胞的活 力，要求在20s以內(nèi)完全融化。將凍存管自液氮中取出，立即放入40℃溫水中，融化后即從水中取出，吸出細(xì)胞懸液，加入10倍的培養(yǎng)液中混勻，繼而低速離 心，盡快洗去保護(hù)劑，再懸于新培養(yǎng)液中，計數(shù)并檢查細(xì)胞活力，然后置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

二、細(xì)胞活力測定

細(xì)胞活力常用百分 比表示，活力的大小對試驗結(jié)果有很大影響。細(xì)胞活力的測定有許多方法，最簡便常用的方法是臺盼藍(lán)(trypanblue)染色法。臺盼藍(lán)又稱錐藍(lán)，是一種 陰離子型染料，這種染料不能透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色，但死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，可使染料通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使死細(xì)胞著色呈 藍(lán)色。

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